Prezentácia na tému "metódy infekcie kuracieho embrya." Kuracie embryo Štruktúra mikrobiológie kuracieho embrya

Väčšina známych vírusov má schopnosť množiť sa v kuracom embryu (obr. 4). Používajú sa embryá vo veku od 8 do 14 dní v závislosti od typu vírusu, spôsobu infekcie a cieľov výskumu. Vírusy chrípky sa kultivujú za 9-10 dní, vakcíny proti kiahňam - za 12 dní, mumps - v 7-dňových kuracích embryách. Reprodukcia vírusu v kuracích embryách sa vyskytuje v rôznych častiach embrya, čo je spôsobené charakteristikami tropizmu vírusu. Technika pestovania vírusu v kuracom embryu je široko používaná v priemyselnej kultivácii.

Štruktúra kuracieho embrya a spôsoby jeho infekcie: 1 - do amniónu; 2 - do alantoickej dutiny; 3 - do žĺtkového vaku. (Mikrobiológia a imunológia. Editoval Vorobyov A.A. - M. - 1999).

Vonkajšia extraembryonálna membrána, ktorá susedí so schránkou alebo materskými tkanivami, a preto slúži ako miesto výmeny medzi embryom a jeho prostredím, sa nazýva Chorion. U druhov, ktoré znášajú vajíčka, je hlavnou funkciou chorionu výmena dýchacích plynov. U cicavcov sa chorion podieľa na dýchaní a výžive, vylučovaní, filtrácii a syntéze látok. U primitívnych organizmov je chorion sekundárnou membránou a u vyspelých organizmov je to membrána plodu. Dutina medzi chorionom a amniom je chorioamniotická dutina.

Amnion(grécky Amnion), amniotický vak alebo vodná membrána - jedna z embryonálnych membrán v embryách plazov, vtákov a cicavcov.

Evolučne amnion vznikol na ochranu embryí pred vysychaním počas vývoja mimo vodného prostredia. Preto sa stavovce, ktoré kladú vajíčka (plazy a vtáky), ako aj cicavce pochádzajúce z plazov, klasifikujú ako amnioty („zvieratá s vaječnými membránami“). Predchádzajúce triedy a nadtriedy stavovcov (hlavonožce, cyklostómy, ryby, obojživelníky) kladú vajíčka do vodného prostredia, nevyžadujú teda vodnú schránku. Tieto triedy zvierat sú spojené do skupiny anamnia. Na rozdiel od anamnie, amnioty nevyžadujú vodné prostredie na rozmnožovanie a skorý vývoj, preto amnioty nie sú pripojené k vodným plochám. Toto je evolučná úloha amniónu.

Pri pôrode cicavcov vodná membrána praskne, voda vytečie a zvyšky amniónu na tele novorodenca sa často nazývajú „tričko“, ktoré je od pradávna všade znakom šťastia a iných povier. časy (teda najmä ruské príslovie o tých, ktorí sa „narodili v košeli“).

Allantois (z gréckeho allantoeid?s - v tvare klobásy) je embryonálny dýchací orgán vyšších stavovcov; zárodočná membrána vyvíjajúca sa zo zadného čreva embrya. Okrem toho sa alantois podieľa na výmene plynov medzi embryom a životné prostredie a uvoľnenie tekutého odpadu. Alantois je spolu s ďalšími embryonálnymi membránami – amniónom a choriom charakteristickým znakom vyšších stavovcov – cicavcov, vtákov a plazov.

U vajcorodých vtákov a plazov sa alantois vyvíja okolo embrya pozdĺž stien škrupiny. Vo svojej vonkajšej vrstve, nazývanej mezoderm, vytvára rozsiahlu sieť krvných ciev, prostredníctvom ktorých interaguje s vonkajším prostredím. U cicavcov je alantois súčasťou pupočnej šnúry.

Existuje niekoľko spôsobov, ako infikovať vyvíjajúce sa kuracie embryo: na chorioalantoickej membráne, v alantoickej a amniovej dutine, žĺtkovom vaku a tele embrya.

Infekcia chorioalantoickej membrány sa používa na izoláciu a kultiváciu vírusov, ktoré tvoria plaky na membránach (vakcínové vírusy, kiahne, herpes simplex). Pred infekciou sa vajíčka vyšetria pomocou ovoskopu a ceruzkou sa načrtne hranica vzduchového priestoru a chorioalantoickej membrány. Povrch vajíčka nad vzdušným priestorom a v mieste infekcie sa utrie alkoholom, spáli, ošetrí jódom a v dutine vzduchového vaku sa vytvorí otvor.

V mieste infekcie sa odstráni škrupina, aby sa nepoškodila podplášťová membrána, ktorá sa následne prepichne krátkou sterilnou ihlou, aby sa nepoškodila chorioalantoická membrána. Vzduch z dutiny vzduchového vaku sa odsaje. Tuberkulínovou striekačkou s krátkou ihlou alebo Pasteurovou pipetou sa na chorioalantoickú membránu aplikuje vírusový materiál (0,05 - 0,2 ml). Otvor v škrupine sa prekryje sterilným krycím sklom alebo rovnakým vyrezaným kusom škrupiny a okraje sa naplnia roztaveným parafínom. Infikované embryá sa umiestnia vodorovne na stojan a inkubujú sa v termostate. Embryá sa vypreparujú najskôr po 48 hodinách inkubácie. Na infikovanej membráne sa nachádzajú belavé nepriehľadné škvrny rôznych tvarov (plaky).

Infekcia v alantoickej dutine. Vírus zavedený do alantoisu sa množí v endodermálnych bunkách a potom prechádza do alantoickej tekutiny. Infekcia sa uskutočňuje nasledujúcim spôsobom: v škrupine nad vzduchovou komorou sa urobí prepichnutie špičkou skalpelu alebo nožníc, po ktorom sa cez otvor vloží ihla s injekčnou striekačkou vo vertikálnom smere, ktorá prechádza cez chorioalantoickej membrány a vstupuje do alantoidnej dutiny, materiál sa vstrekne v objeme 0,1 ml a otvor sa naplní parafínom.

Infekcia v žĺtkovom vaku. Na tento účel sa embryá 5 - 10 - jednodňový. Najbežnejšie sú dva spôsoby infekcie. Podľa prvého sa materiál zavádza cez vzduchový priestor. V strede vajíčka sa vytvorí otvor, umiestni sa na stojan s tupým koncom doprava a cez otvor sa vo vertikálnom smere vloží ihla napojená na injekčnú striekačku; ihla prechádza cez chorioalantoickú membránu, alantoickej dutiny do žĺtka. Do žĺtkového vaku sa môže vstreknúť 0,1 až 0,5 ml materiálu obsahujúceho vírus. Po infekcii sa otvor v škrupine naplní parafínom a embryo sa umiestni do termostatu. Podľa druhého spôsobu sa na hranici vzduchového priestoru na strane, kde leží žĺtok (strana opačná od embrya), urobí punkcia v škrupine, cez ktorú sa zavedie infekčný materiál. Smer ihly by mal smerovať k stredu vajíčka.

Kuracie embryo infikované vírusovým materiálom sa umiestni do inkubátora na 2-3 dni, v závislosti od povahy zavedeného vírusu. Na vývoj vírusov zo vzoriek odobratých pacientovi (napríklad výtery z nosohltanu používané na diagnostiku chrípky) poskytuje kuracie embryo dobré prostredie. Podľa typu zmien, povedzme, v tkanivách chorioalantoickej membrány môžeme priamo určiť, s akým druhom vírusu máme dočinenia. Kiahne a herpes vírusy spôsobujú veľmi charakteristické zmeny. Niektoré vírusy sa veľmi intenzívne množia v rôznych tkanivách kuracieho embrya a vyvolávajú vznik Surový materiál na prípravu vírusových antigénov potrebných na laboratórnu diagnostiku vírusových ochorení. Vírusy množené v kuracích embryách sa použili ako východiskový materiál na výrobu osemnástich typov očkovacích vakcín.

Napriek tomu pozitívne stránky bunkových kultúrach, ktoré sa v moderných virologických laboratóriách tak rozšírili, si kuracie embryo v mnohých prípadoch zachovalo svoje prvenstvo a naďalej slúži ako klasický materiál pre prácu. Indikácia vírusu v kuracom embryu sa uskutočňuje smrťou embrya, pozitívnou hemaglutinačnou reakciou na skle s alantoickou alebo plodovou vodou, tvorbou fokálnych lézií („plakov“) na chorion-alantoidnej membráne, ako aj v RHA.

Embryá sa používajú vo veku 8 až 14 dní v závislosti od typu vírusu a spôsobu infekcie. Reprodukcia u kuracích embryí prebieha v rôznych častiach embrya.Spôsoby infekcie: na chorioalantoickej membráne, v alotonickej a amniotickej membráne, žĺtkovom vaku, tele embrya.

29.Tkanivové kultúry.

V závislosti od techniky prípravy existujú 3 typy buniek:

Jednovrstvové sklo sa môže reprodukovať na povrchu chemicky neutrálneho skla vo forme monovrstvy;

Suspenzia, ktorá sa šíri po celom objeme živného média;

Orgány sú celé časti orgánov a tkanív, ktoré si zachovávajú svoju pôvodnú štruktúru.

Príprava primárnej bunkovej kultúry pozostáva z niekoľkých fáz: mletie tkaniva, oddelenie buniek a premytie výslednej suspenzie z trypsínu.

Indikácia:

- cytopatický účinok - morfologické zmeny v bunkách viditeľné pod mikroskopom, až po odmietnutie zo skla.

Vírusové inklúzie sú akumuláciou vírusových častíc alebo separáciou vírusových zložiek v cytoplazme alebo jadre buniek.

Plaky sú obmedzené oblasti pozostávajúce z degeneratívnych buniek. Sú viditeľné ako svetlé škvrny na pozadí farebných buniek.

Farebný test

Hemadsorpcia je schopnosť bunkových kultúr adsorbovať červené krvinky na svojom povrchu.

Rušenie.

30. Klasifikácia, chemické zloženie bakteriofágov.

Bakteriofágy sú bakteriálne vírusy, ktoré majú schopnosť prenikať do bakteriálnych buniek a spôsobiť ich rozpustenie. Majú tvar pulca, niektoré sú kubické nitkovité. Skladajú sa z ikosaedrickej hlavy a chvosta. Vo vnútri kaudálneho výbežku je valcovitá tyčinka, vonku je puzdro, výbežok končí šesťhrannou bazálnou platničkou s krátkymi tŕňmi. Fágy sú zložené z nukleovej kyseliny a proteínu. Vo fágoch v tvare spermií je dvojvláknová DNA pevne zabalená do špirály vo vnútri hlavy. Bielkoviny sú súčasťou škrupiny. Okrem štrukturálnych proteínov boli objavené aj vnútorné proteíny spojené s nukleovou kyselinou a enzýmové proteíny zapojené do interakcie fágu s bunkou.

31. Proces interakcie medzi virulentnými fágmi a bakteriálnou bunkou citlivou na ne

Počet virulentných fágov sa môže zvyšovať iba počas lytického cyklu. Proces interakcie medzi virulentným bakteriofágom a bunkou pozostáva z niekoľkých fáz: adsorpcia bakteriofága na bunku, penetrácia do bunky, biosyntéza zložiek fágu a ich zostavenie a uvoľnenie bakteriofágov z bunky.

Spočiatku sa bakteriofágy naviažu na fágovo špecifické receptory na povrchu bakteriálnej bunky. Fágový chvost pomocou enzýmov umiestnených na jeho konci (hlavne lyzozýmu) lokálne rozpúšťa bunkovú membránu, sťahuje sa a DNA obsiahnutá v hlavičke sa vstrekuje do bunky, zatiaľ čo proteínový obal bakteriofága zostáva vonku. Injikovaná DNA spôsobuje úplnú reštrukturalizáciu metabolizmu bunky: zastaví sa syntéza bakteriálnej DNA, RNA a proteínov. DNA bakteriofága sa začne prepisovať pomocou vlastného enzýmu transkriptázy, ktorý sa aktivuje po vstupe do bakteriálnej bunky. Najprv sa syntetizujú skoré a potom neskoré mRNA, ktoré vstupujú do ribozómov hostiteľskej bunky, kde sa syntetizujú skoré (DNA polymerázy, nukleázy) a neskoré (kapsidové a chvostové proteíny, enzýmy lyzozým, ATPáza a transkriptáza) bakteriofágové proteíny. Replikácia bakteriofágovej DNA prebieha podľa semikonzervatívneho mechanizmu a uskutočňuje sa za účasti vlastných DNA polymeráz. Po syntéze neskorých proteínov a dokončení replikácie DNA sa začína konečný proces – dozrievanie fágových častíc alebo spojenie fágovej DNA s obalovým proteínom a vznik zrelých infekčných fágových častíc.

Infekcia chorioalantoickej membrány. Táto metóda je jednou z najpoužívanejších. Jeho hlavnou výhodou je, že množstvo vírusov pri množení na chorioalantoickej membráne spôsobuje jej charakteristické zmeny a vytvára lézie vo forme belavých škvŕn - plakov rôznych morfológií.

Na infekciu sa používajú embryá staré 10-12 dní. Typicky je chorioalantoická membrána preniknutá vytvorením otvoru v škrupine nad vzduchovým vakom alebo na strane vajíčka.

Hlavné štádiá infekcie na chorioalantoickej membráne zo vzdušného priestoru:

1. Vajíčko sa položí na stojan v vertikálna poloha
tak, aby bol airbag hore)"; vykonajte
dôkladná sterilizácia škrupiny na tupom konci vajíčka.

2. Škrupina je prepichnutá nad stredom vzduchového vaku.
pomocou pitevnej ihly.

3. Čeľusť nožníc sa vloží do výsledného otvoru a
do škrupiny vyrežte okienko s priemerom asi 1,5 cm. (Kde
Nedovoľte, aby sa kúsky škrupiny dostali dovnútra vajíčka).

4. Cez vytvorený otvor je viditeľný vnútorný list
škrupinová membrána, je opatrne roztrhnutá s okom
pinzetou alebo ihlou a odlúpnite malá plocha (0,5-1
cm 2), čím sa odkryje chorioalantoická membrána.

5. Infikuje chorioalantoickú membránu
aplikáciou 0,1-0,2 ml materiálu obsahujúceho vírus
(napríklad vírus vakcínie) pomocou Pasteurovej pipety
alebo injekčná striekačka.

6. Okienko v plášti je uzavreté špeciálnou gumičkou
fólie, sterilné krycie sklíčko alebo sklo
čiapka. Na pripevnenie skla a uzáveru k mušli
použite roztavený parafín.

Infikované embryá sa umiestnia do termostatu vo vertikálnej polohe a inkubujú sa 2-3 dni, po ktorých sa vykoná pitva podľa nasledujúcich pravidiel:

1. Vajíčko je umiestnené na stojane tak, aby vzduch
priestor bol navrchu, miesto sa sterilizuje
nadchádzajúce otvorenie vhodným spracovaním
alkohol a jód.

2. Po odstránení filmu, krycieho sklíčka alebo uzáveru,
Pomocou sterilných nožníc odrežte škrupinu pozdĺž hranice vzduchu
priestor.

3. Pomocou pinzety odstráňte škrupinu.
Odkrytá chorioalantoická membrána (ktorá môže
byť viditeľné zmeny) sú orezané pozdĺž okraja škrupiny. Cez
vzniknutý otvor vylejeme celý obsah vajíčka do pohára
alebo zásobník.

4. Zvyšné chorioalantoické tkanivo vo vnútri škrupiny
škrupina sa opatrne vyberie pinzetou a vloží sa
sterilný pohár s fyziologickým roztokom. Tu to je
narovnajte a študujte zmeny umiestnením pohára na tmu
pozadie.

Aby sa získal materiál obsahujúci vírus z chorioalantoickej membrány, musí sa rozdrviť nožnicami a potom rozdrviť v mažiari s kremenným sklom a pridať soľný roztok. Výsledná suspenzia sa odstreďuje pri 2000 otáčkach za minútu počas 10-15 minút a použije sa supernatant! ako materiál obsahujúci vírus (vyžaduje sa povinné testovanie na neprítomnosť bakteriálnej kontaminácie).

Infekcia v alantoickej dutine. Táto metóda

Vyznačuje sa jednoduchosťou a je cenný, pretože prispieva k významnej akumulácii vírusu. Na infekciu sa zvyčajne odoberajú embryá vo veku 10 dní. Hlavné štádiá infekcie v alantoickej dutine:

}. Vajíčko sa položí na stojan tupým koncom nahor a škrupina sa sterilizuje nad vzdušným priestorom.

2. V strede tupého konca sa v škrupine urobí vpich s
pomocou pitevnej ihly.

3. Ihla injekčnej striekačky obsahujúca riedenie sa vloží do otvoru
vírus (ako je vírus chrípky). Ihla je zasunutá do
vertikálnom smere 2-3 mm pod úrovňou vzduchu
vrecka a potom vstreknite OD-0,2 ml materiálu.

4. Otvor v plášti je utesnený pomocou
roztavený sterilný parafín.

Infikované embryá sa uchovávajú v termostate zvyčajne 2 dni. Vajíčka pred otvorením vložíme na noc do chladničky pri 4°. Otváranie sa vykonáva v nasledujúcom poradí:

1. Vajíčko sa položí na stojan tak, že vzduchový vak je hore, škrupina nad ním je sterilizovaná;

2. Nožnicami odrežte škrupinu trochu vyššie
hranice vzdušného priestoru.

3. Potom pomocou pinzety opatrne vyberte škrupinu
prečo je chorioalantoická membrána prepichnutá Pasteurom
napipetujte na miesto, kde nie sú cievy, a odsajte alantoikum
kvapalina (môžete zhromaždiť 5-6 ml).

4. Alantoidná tekutina sa prenesie do sterilnej
skúmavka a časť sa naočkuje do bujónu na kontrolu
bakteriologická sterilita.

Metóda infekcie alantoickej dutiny sa často používa na kultiváciu vírusu chrípky, ako aj mumpsu a vakcínie.

Infekcia v amniovej dutine

Táto metóda je náročnejšia na vykonanie a používa sa o niečo menej často ako predchádzajúce. Jeho zvláštnosťou je, že pri infekcii niektorými pneumotropnými vírusmi (napríklad vírusmi chrípky, mumpsu) sa tieto množia nielen v bunkách amniovej membrány, ale aj v dýchacieho traktu a pľúcne tkanivo embrya, kam preniká infikovaná tekutina. Na infekciu sa používajú embryá staré 7-12 dní. Infekcia do amniotickej dutiny sa uskutočňuje pomocou otvorenej metódy, keď sa na zavedenie materiálu do škrupiny urobí relatívne málo. veľká diera alebo uzavretou metódou, keď sa infekcia uskutočňuje prepichnutím škrupiny.

Prvý z nich je traumatickejší, druhý je menej spoľahlivý, pretože pri slepom konaní nie je vždy možné vložiť ihlu do amniovej dutiny.

Technika otvorenej infekcie:

1. Vajíčko sa položí na stojan a sterilizuje
škrupina v oblasti tupého konca.

2. Nad stredom vzdušného priestoru v plášti
Pomocou nožníc vystrihnite okienko s priemerom 2 cm (ako
na infekciu na chorioalantoickej membráne).

3. Opatrne odstráňte vnútorný list škrupiny
membránu pomocou pinzety, odhaľujúc podklad
chorioalantoická membrána.

Pomocou nožníc vyrežte malý otvor
chorioalantoická membrána v mieste, kde nie sú žiadne cievy, a do rezu sa vloží očná pinzeta. Amniová membrána sa uchopí pinzetou a amniotický vak sa vytiahne cez povrch chorioalantoickej membrány.

5. Držanie amniotickej membrány v tejto polohe,
infikovať amniovú dutinu injekciou 0,1-
0,2 ml riedenia vírusu.

6. Otvor v škrupine je uzavretý sterilným uzáverom.
alebo krycie sklo pomocou na ich upevnenie a
utesnenie vajíčka roztaveným parafínom.

Infikované embryá sa inkubujú 2 dni, mŕtve sa vyhodia počas prvého dňa (pozorovania sa robia cez okienko v škrupine). Po otvorení sa embryá uchovávajú cez noc v chladničke pri 4 °C.

Technika otvárania embrya počas infekcie v amniotickej dutine:

1. Po sterilizácii miesta nadchádzajúcej pitvy ho odrežte
škrupina mierne nad okrajom vzduchového vaku.

2. Chorioalantoická membrána je prepichnutá
pasteurovou pipetou a odstráňte alantoidnú tekutinu.

3. Uchopenie plodového vaku pinzetou, prepichnutie
jeho membrána s injekčnou ihlou alebo Pasteurovou pipetou a
sa odsaje amnestická tekutina (od 0,5 do 1,5 ml). U
infikované embryo, medzitým by mala byť tekutina zakalená
ako normálne embryo je priehľadné.

4. Odobratá tekutina sa prenesie do sterilnej skúmavky, 0,1-
0,3 ml sa naočkuje do bujónu na kontrolu bakteriológie
sterilita.

Účel lekcie

Oboznámiť študentov s metódami výberu kuracích embryí na kultiváciu vírusov.

Vybavenie a materiály

Kuracie embryá 9-12 dní inkubácie, ovoskop, alkoholové tampóny, stojany na embryo, pinzeta, nožnice, lepiaca páska, ihly, striekačky, ceruzky, dierovače, ihly, tabuľky, schémy, multimediálne vybavenie, prezentácie MS Office Power Point na tému lekcie.

Metodika vedenia vyučovacej hodiny a usmernenia na túto tému

Vysvetlenie učiteľa

Kultivácia vírusov na kuracích embryách je najdostupnejšou a najpohodlnejšou metódou na primárnu izoláciu vírusu. Prax používania tejto metódy infekcie ukázala množstvo výhod oproti iným metódam. Na infekciu sa používajú embryá 5 až 12 dní inkubácie.

VÝHODY A NEVÝHODY kuracích embryí AKO BIOLOGICKÝCH OBJEKTOV

Kultivácia vírusov v kuracích embryách je najdostupnejšou a najpohodlnejšou metódou ako na primárnu izoláciu vírusov z chorých zvierat a z objektov prostredia, tak aj na následnú kultiváciu vírusov v laboratóriu. Táto metóda je široko používaná na identifikáciu vírusov a protilátok, ako aj na prípravu vakcín a diagnostiku. Prax ukázala množstvo výhod tejto metódy oproti kultivácii vírusov na laboratórnych zvieratách. Je známe, že biele myši, ktoré sú široko používané vo virologických štúdiách, sa môžu spontánne infikovať množstvom vírusových infekcií: ektroméliou, lymfocytovou choriomeningitídou, Taylorovou encefalitídou, vírusovou pneumóniou, Sendai vírusom a ďalšími, čo mimoriadne komplikuje prácu a často vedie k k chybným záverom pri posudzovaní získaných výsledkov.výsledkov. Kultivácia vírusov na kuracích embryách do značnej miery odstraňuje uvedené ťažkosti. Spolu s tým možno z kuracieho embrya získať podstatne väčšie množstvo vírusu ako z laboratórnych zvierat. Kuracie embryo má väčšiu životaschopnosť a odolnosť voči rôznym typom vplyvov, ktoré sú nevyhnutné pri zavádzaní testovaného materiálu. Pri známej zručnosti pri práci s embryami a dodržiavaní pravidiel asepsie je ich smrť bezvýznamná. K najväčšiemu plytvaniu embryí dochádza pri zavádzaní materiálu do amniovej dutiny a žĺtkového vaku, no ani v týchto prípadoch nepresahuje 10–15 % pri splnení potrebných inkubačných podmienok.

Kuracie embryá ako živý systém vstúpili do virologickej praxe v 30. rokoch 20. storočia. Ich použitie rozšírilo sortiment pestovaných laboratórne podmienky vírusy, umožnili úspešnejšie riešiť problémy, ktorým čelí virológia, pretože kuracie embryá majú oproti laboratórnym zvieratám množstvo výhod: 1) škrupina a podškrupinová membrána spoľahlivo chráni embryo pred bakteriálnou infekciou z vonkajšieho prostredia; 2) dôležitou výhodou embryí je aj ich vysoká citlivosť na široké spektrum vírusov, čo sa vysvetľuje nedostatočným vyvinutím ochranných mechanizmov; 3) kuracie embryá sú ľahko dostupným objektom vďaka rozvoju širokej siete hydinových fariem a liahní; 4) kuracie embryá sú ekonomické a nevyžadujú starostlivosť ani kŕmenie.

Hlavnými nevýhodami sú: 1) nemožnosť úplne zaručiť sterilitu tohto živého systému, pretože embryá môžu vo svojom obsahu niesť vírusy a iné patogénne agens (vírusy kuracieho infekčného zápalu priedušiek, pseudomoru hydiny, chrípky, leukémie, chlamýdií a mykoplazmy). Ich prítomnosť môže skresliť výsledky štúdie; 2) kuracie embryá nie sú citlivé na všetky vírusy.

ÚČELY POUŽITIA KURACÍCH EMBRYÍ

Kuracie embryá sa vo virológii používajú hlavne na rovnaké účely ako laboratórne zvieratá, a to:

– detekcia aktívneho vírusu biotestom v patologickom materiáli;

– primárna izolácia vírusu. Vírusy, ktoré spôsobujú choroby vtákov, ako aj niektoré vírusy cicavcov, sú účinne izolované a kultivované na kuracích embryách;

– udržiavanie vírusov v laboratóriu;

– titrácia vírusov;

– akumulácia vírusu na laboratórny výskum a získanie vakcín;

– ako skúšobný objekt v neutralizačnej reakcii.

POŽIADAVKY NA KURACIE EMBRYÁ

Vajcia sa musia získavať z fariem bez vírusových ochorení. Oplodnené vajcia, dokonca aj od klinicky zdravých kurčiat, môžu obsahovať rôzne vírusy nachádzajúce sa u týchto vtákov: pseudomor, infekčnú bronchitídu, infekčnú laryngotracheitídu, encefalomyelitídu, parainfluenzu-2, polyartritídu, ovčie kiahne, arbovírusy, adenovírusy atď. Prítomnosť týchto vírusov môže na jednej strane vedú k diagnostickým chybám a na druhej strane na základe javu interferencie k potlačeniu reprodukcie vírusu nachádzajúceho sa v testovanej vzorke. Embryá, ktoré neobsahujú vírus, ale sú získané z kurčiat asymptomaticky infikovaných určitými vírusmi, môžu byť tiež menej citlivé alebo úplne necitlivé na účinky daného vírusu v dôsledku prítomnosti špecifických protilátok získaných od matky so žĺtkom. Pre úspešnú izoláciu vírusu je potrebné, aby kurčatá, ktorých embryá sa pri práci používajú, neboli vakcinované proti chorobe, ktorej pôvodca sa hľadá. Vaječné škrupiny musia byť nepigmentované a čisté (nedá sa umývať). Vek embrya musí zodpovedať zvolenému spôsobu infekcie.

Poskytnúť normálny vývoj embryá v oplodnených vajíčkach počas inkubačnej doby musia byť udržiavané pri určitej teplote a vlhkosti. Vyvíjajúce sa embryá znášajú prehriatie oveľa horšie ako ochladzovanie. Krátkodobá (v priebehu niekoľkých hodín) porucha vykurovacieho systému preto nespôsobí veľkú škodu. Pri dlhšej prestávke je potrebné zahriatie.

Násadové vajcia potrebujú voľný prístup čerstvý vzduch, ktorý vstupuje cez prieduchy. Musia byť vždy otvorené. Jedno vajce, ako sa bežne verí, spotrebuje 1 liter kyslíka denne, čo nie je prekvapujúce, ak si spomenieme na rýchly vývoj embrya počas 21 dní inkubácie. Vajcia by sa preto nemali umiestňovať tesne vedľa seba, ani jedno na druhé. Bežné termostaty nie sú vhodné na inkubáciu vajec. Na tieto účely ich možno použiť len v krajných prípadoch, no zároveň ich často vetrajte a dovnútra umiestnite nádobu s vodou, ktorá zabezpečí potrebnú vlhkosť.

Vajíčka znesené na inkubáciu sa vyšetrujú po 3–5 dňoch pomocou špeciálnej stolovej alebo ručnej lampy (ak sa vajíčka nevyberú z podnosu inkubátora), aby sa vybrali neoplodnené. Leghorn vajcia sú najvhodnejšie na virologickú prácu, pretože ich tenká biela škrupina umožňuje lepší prehľad o obsahu. Vajíčka, ktoré nie sú oplodnené alebo obsahujú mŕtve embryá, sa z inkubátora odstránia. Podiel oplodnených vajíčok sa značne líši v závislosti od mnohých faktorov vrátane ročného obdobia: na jar je najvyšší, v zime je najnižší.

Embryá sa druhýkrát skenujú v deň plánovanej infekcie. Toto obdobie závisí od typu vírusu, ako aj od cesty jeho zavedenia. Miesto infekcie je označené na škrupine obyčajnou (nie atramentovou) ceruzkou.

ŠTRUKTÚRA KURACIEHO EMBRYA

Kurča zvyčajne znáša oplodnené vajíčko, v ktorom je embryo v štádiu blastuly alebo skorej gastruly. Keď sa vajíčko zahreje na teplotu blízku telesnej teplote kurčaťa, dôjde k ďalšiemu vývoju embrya (obr. 15). V období od 5. do 12. dňa inkubácie môžu byť kuracie embryá použité na infekciu vírusmi.

Obrázok 15 - Schematický rez kuracím embryom na 8. deň inkubácie: 1 – škrupina; 2 – podplášťová membrána; 3 – chorioalantoická membrána; 4 – alantoická dutina; 5 – žĺtkový vak; 6 – proteín; 7 – vzduchová komora; 8 – telo embrya; 9 – plodová dutina

Vajíčko s vyvíjajúcim sa kuracím zárodkom je zvonku pokryté tvrdou, pórovitou škrupinou, ku ktorej tesne prilieha podškrupinová membrána. Ten je na tupom konci vajíčka rozdelený na dva listy, medzi ktorými je vytvorená vzduchová komora. Telo embrya leží excentricky vo vajci, jeho chrbát je bližšie k škrupine a jeho hlava smeruje k vzduchovej komore. Embryo je ponorené do plodovej vody, ktorá vypĺňa amniovú dutinu a je spojené so žĺtkom pupočnou šnúrou. Žĺtok je tiež umiestnený excentricky a relatívne k embryu, akoby na druhej strane pozdĺžnej osi.

Priamo pod škrupinovou membránou je alantoická dutina, ktorá pokrýva amnion a žĺtkový vačok, a na 10.-11. deň je uzavretá v ostrom konci vajíčka. Počas vývoja sa alantoická membrána spája s chorionom a vytvára jedinú chorioalantoidnú membránu (CAO). Na ostrom konci vajíčka je zvyšok bielkovín.

Infekcia v jednej alebo druhej časti embrya sa uskutočňuje počas obdobia jeho maximálneho vývoja, keď je počet citlivých buniek najväčší.

Počas inkubačného procesu sa veľkosť embryonálnych štruktúr mení, čo sa do značnej miery vysvetľuje ich funkčným účelom a určuje optimálny vek embrya na infekciu.

Žĺtkový vak ako zásobáreň živín má teda najväčší objem na začiatku inkubácie a následne (po 12. dni) pri vývoji embrya sa zmenšuje. Infikujte žĺtkový vak od 5. do 7. dňa inkubácie.

Plodová dutina, ktorá je tlmivým prostredím pre vývoj embrya, ho pokrýva už na 5. deň inkubácie. Priemerné množstvo tekutiny v strede inkubačnej doby je asi 1 ml.

Na infekciu do amniovej dutiny sa používajú embryá vo veku 6-10 dní.

Alantoická dutina slúži na zhromažďovanie metabolických produktov, hromadia sa v nej soli kyseliny močovej, zlúčeniny fosforu a dusíka. Počas rastu a vývoja embrya sa alantoická tekutina stáva kyslou. Alantoidná dutina dosahuje maximálnu veľkosť na 9. – 12. deň vývoja embrya, preto infekcia do alantoidnej dutiny prebieha hlavne v 9. – 11. deň inkubácie.

Chorioallantoická membrána je bohatá na krvné cievy, ktoré tesne priliehajú k vnútornému povrchu poréznej škrupiny, sú nasýtené kyslíkom a dodávajú ho do tela embrya, pričom vykonávajú funkciu dýchacieho orgánu embrya. CAO dosiahne svoj maximálny rozvoj na 11-13 deň. Infekcia chorioalantoickej membrány sa uskutočňuje 10. až 12. deň inkubácie.

PRÍPRAVA kuracích embryí NA INFEKCIU

Embryá sa prepravujú z liahne bez toho, aby boli počas cesty ochladzované. V laboratóriu sa embryá inkubujú v termostate pri teplote 37 °C a vlhkosti 60 – 70 %, čo sa dosiahne umiestnením otvorených nádob so širokým hrdlom s vodou do termostatu. Vetracie otvory termostaty musia byť otvorené. Embryá sú umiestnené vzduchovou komorou smerom nahor do špeciálnych stojanov. Odporúča sa nechať embryá adaptovať sa na nové podmienky do 24 hodín pred infekciou a normalizovať ich funkcie po transportnom strese. Ak má laboratórium vlastnú liaheň, potom oplodnené vajíčka znesené kuracím sú vhodné na znášku do 10 dní.

Príprava kuracích embryí na infekciu zahŕňa ovoskopovanie a dezinfekciu škrupiny, ako aj vhodnú prípravu pracoviska. Ovoskoping zahŕňa pozorovanie vajíčok proti dostatočne jasnému zdroju svetla (ovoskop), v dôsledku čoho sa na neosvetlenej strane škrupiny vytvárajú tiene z vnútorných štruktúr (obr. 16). Ovoskopia sa vykonáva v tmavej miestnosti. Zároveň je na plášti grafitovou ceruzkou vyznačený okraj vzduchovej komôrky, umiestnenie embrya a úsek avaskulárnej zóny s rozmermi 0,5x0,5 cm.Tieto značky slúžia ako vodítko pri výbere miesto na zavedenie materiálu obsahujúceho vírus. Pri ovoskopii sa zisťuje aj to, či je embryo živé alebo mŕtve. Embryá, ktoré vykazujú aktívne pohyby s dobrým prekrvením ciev CAO, sa považujú za živé.

Obrázok 16 - Ovoskopovanie kuracieho embrya na 10. deň inkubácie. Viditeľné sú tiene: 1 – embryo; 2 – žĺtkový vak; 3 – krvné cievy XAO; 4 – vzduchová komora; 5 – veverička

Kuracie embryá sa infikujú za aseptických podmienok (najlepšie v krabici). V predboxovacej miestnosti sa obaly embryí ošetria jódovaným liehom, potom sa v boxe opäť utrú a niekedy sa aj flambujú – ošetria plameňom tampónu navlhčeného alkoholom.

Embryá sú fixované v špeciálnych stojanoch inštalovaných v emailovej kyvete na 3-4-vrstvovej gázovej utierke navlhčenej dezinfekčným roztokom.

Nástroje používané pri tejto práci sa sterilizujú varom. Pred každým opätovným použitím sa umiestnia do pohára s alkoholom a spália plameňom horáka.

Demonštrácia

a) klinické príznaky choroby u infikovaných laboratórnych zvierat; b) metódy usmrcovania laboratórnych zvierat; c) techniky pitvy (upozorniť študentov na stav vnútorných orgánov) a metódy na získanie materiálu obsahujúceho vírus; d) techniky na vytváranie odtlačkov mozgu; e) úkony na dezinfekciu pracoviska a mŕtvoly po pitve nakazeného zvieraťa.

Úlohy

1. Preštudujte si štruktúru kuracieho embrya.

2. Vykonajte ovoskopiu kuracieho embrya, určte jeho životaschopnosť a označte hranice tieňov prírodných útvarov.

3. Pripravte kuracie embryá na infekciu.

Samostatná prácaštudentov

a) rozpoznanie myší infikovaných každým študentom podľa farebnej značky, rozbor ich klinického stavu, usmrtenie, fixácia v kyvete s voskovým (parafínovým) dnom, pitva; b) analýza patologických zmien, získanie materiálu obsahujúceho vírus (parenchýmové orgány), príprava odtlačkov mozgu po vrstvách.

Študenti vykonajú ovoskopiu kuracieho embrya, zistia jeho životaschopnosť a vyznačia hranice tieňov prírodných útvarov.

Zhrnutie lekcie

Úloha na ďalšiu lekciu

Kontrolné otázky

1. Štruktúra kuracieho embrya.

2. Prečo sa vo virológii používajú kuracie embryá?

3. Aká je štruktúra vyvíjajúceho sa kuracieho embrya?

Účel lekcie: oboznámiť študentov s metódami infikovania kuracích embryí na kultiváciu vírusov.

Vybavenie a materiály: kuracie embryá 9-12 dní inkubácie, ovoskop, alkoholové tampóny, stojany na embryá, pinzeta, nožnice, lepiaca páska, ihly, striekačky, ceruzky, dierovače, ihly, tabuľky, schémy, multimediálne vybavenie, prezentácie MS Office Power Point na tému lekcie.

Vysvetlenie učiteľa.

Spôsob infekcie výrazne ovplyvňuje rozmnožovanie vírusov v embryách. Pred infekciou sa inkubované vajíčka zapália a mŕtve sa oddelia. Na škrupinách vajíčok so živými embryami, ktoré sa vyznačujú červenou farbou ciev a pohybom embrya, je miesto infekcie označené ceruzkou.

Embryá sa infikujú v sterilnom boxe s pracovným stolom, dvomi stoličkami, prívodom plynu, vodou a vákuom. Infekcia do amniotickej dutiny sa vykonáva v tmavej miestnosti. Pracovisko by mal byť dobre osvetlený. Pred prácou je stôl dezinfikovaný. Na dezinfekciu povrchu vajíčok si pripravte antiseptický roztok (70% alkohol, 2% roztok jódu) a drevenú paličku obalenú vatou, zahnutú zubnú sondu alebo vŕtačku na vŕtanie. vaječné škrupiny. Vajcia sa infikujú pomocou sterilných injekčných striekačiek na tuberkulinizáciu a špeciálnych ihiel. Miesto infekcie na vajci je vyplnené parafínom. Na tento účel sa pripravia parafínové tyčinky: do skúmavky naplnenej roztaveným parafínom sa vloží sklenená tyčinka, pričom sa uistite, že je v strede skúmavky, kým parafín nevychladne.

Keď je potrebná parafínová tyčinka, steny skúmavky sa nahrejú na horáku a parafín sa zo skúmavky vytiahne pomocou sklenenej tyčinky. Držte palicu nad plameňom a rozpustite množstvo parafínu potrebné na uzavretie otvoru vo vajci. Táto metóda je veľmi čistá a neprodukuje parafínové výpary.

Okrem toho je na pracovnom stole v krabici umiestnený pohár so sterilnými vatovými tampónmi, pohár s 3% roztokom lúhu sodného na použité nástroje a nádoba s roztokom chloramínu na použité sklenené predmety. V prípade potreby si môžete pripraviť pohár na vajíčka, malý smaltovaný pohár a sterilné kultivačné médiá. Takto pripravený pracovný stôl sa vystaví UV žiareniu na 1-2 hodiny.

Vzhľadom na patogenitu skúmaných vírusov sa pri práci používa maska, gumené rukavice a ochranné okuliare.

Existuje šesť spôsobov infikovania embryí. Najčastejšie sa využíva infekcia do alantoidnej dutiny a chorioallantoickej membrány, menej často do amniovej dutiny a do žĺtkového vaku, veľmi zriedkavo do tela embrya a do ciev CAO. Výber metódy je určený tropizmom vírusu, ako aj účelom infekcie. Pri akomkoľvek spôsobe infekcie sa vstrekuje 0,1-0,2 ml infekčného materiálu.

Infekcia v alantoickej dutine.

Pri infikovaní touto metódou sa dobre množia vírusy chrípky, pseudomor, rinopneumónia koní, vezikulárna stomatitída atď.. Existuje niekoľko variantov metódy.

Prvá možnosť. Embryo je fixované vertikálne s tupým koncom nahor. Otvor s priemerom asi 1 mm sa vytvorí v škrupine na strane embrya a niekedy na strane protiľahlej k embryu, 5-6 mm nad okrajom vzduchovej komory. Ihla sa zavedie rovnobežne s pozdĺžnou osou do hĺbky 10-12 mm (obr. 16). Po injekcii materiálu obsahujúceho vírus sa ihla odstráni a otvor v škrupine sa uzavrie kvapkou roztaveného sterilného parafínu.

Obrázok 16. Infekcia v alantoickej dutine (prvá možnosť) (podľa Nikolaoua)

Druhá možnosť. Otvor vytvorený v plášti nad vzduchovou komorou sa používa len na to, aby umožnil únik časti vzduchu. Otvor pre samotnú infekciu je vytvorený v oblasti avaskulárnej zóny chorioalantoickej membrány (CAO) na strane embrya. Ihla je vložená do hĺbky nie väčšej ako 2-3 mm. Vstreknite infekčnú tekutinu v objeme 0,1-0,2 ml a otvor uzavrite parafínom (pozri obr. 17).

Infekcia chorioalantoickej membrány.

Tento spôsob infikovania kuracích embryí sa často používa na kultiváciu epiteliotropných a pantropických vírusov kiahní, infekčnej laryngotracheitídy vtákov, psinky, Aujeszkého choroby, katarálnej horúčky oviec atď.

Takáto infekcia sa môže uskutočniť prostredníctvom prirodzenej alebo umelej vzduchovej komory.

Na infekciu cez prirodzenú vzduchovú komoru embryo sa umiestni zvisle na statív tupým koncom nahor a v plášti proti stredu vzduchovej komory sa vyreže okrúhle okienko s priemerom 15 až 20 mm. Cez toto okienko sa pomocou pinzety odstráni podškrupinová membrána. Na exponovanú oblasť CAO sa nanesie 0,2 mm suspenzie obsahujúcej vírus (obr. 18), otvor sa uzavrie lepiacou náplasťou alebo menej často krycím sklom spevneným roztaveným parafínom.

Infekcia cez umelú vzduchovú komoru sa používa častejšie ako prvý, pretože zabezpečuje kontakt materiálu obsahujúceho vírus s väčším povrchom CW, a preto vedie k tvorbe väčšieho množstva vírusu.

Obrázok 17. Infekcia kuracieho embrya v alantoickej dutine (druhá možnosť) (podľa Nikolaoua)

Obrázok 18. Infekcia v KhAO cez prirodzenú vzduchovú komoru (podľa Nikolaou et al.)

Obrázok 19. Infekcia kuracieho embrya na KhAO cez umelú vzduchovú komoru (podľa Nikolaou et al.)

Aby sa embryo infikovalo touto metódou, umiestni sa vodorovne do stojana s embryom smerom nahor. V škrupine sú vytvorené dva otvory: jeden malý nad stredom vzduchovej komory (určený na nasávanie vzduchu z nej) a druhý s priemerom 0,2 - 0,5 cm na boku, na strane embrya. Zložitosť metódy spočíva v tom, že pri vytváraní druhého otvoru musíte najskôr opatrne odstrániť kúsok škrupiny, potom kĺzavým pohybom, bez poškodenia chemickej látky, presunúť škrupinu na stranu, aby vzduch mohol prechádzať výsledným defekt. Potom sa cez prvý otvor (obr. 19, a) pomocou gumenej guľôčky vzduch z prirodzenej vzduchovej komory odsaje. Výsledkom je, že bočným otvorom vnikne vonkajší vzduch dovnútra, čím sa vytvorí umelá vzduchová komora, dno z ktorých je XAO (obr. 19, b).

Cez bočný otvor sa na povrch CAO nanesie infekčná tekutina a otvor sa uzavrie kúskom lepiacej pásky. Nie je potrebné uzatvárať prvý otvor, pretože vnútorná vrstva membrány plášťa nie je týmto spôsobom infekcie poškodená a naďalej pôsobí ako bariéra pre mikroflóru prostredia.

Ďalšia inkubácia embryí infikovaných touto metódou sa uskutočňuje v horizontálnej polohe s bočným otvorom smerom nahor.

Infekcia v žĺtkovom vaku.

Väčšinou sa využíva na rozmnožovanie chlamýdií, ale aj vírusov Marekovej choroby, rinopneumónie koní, katarálnej horúčky oviec a pod. Infikujú embryá staré 5-7 dní, niekedy aj 2-3 dni staré (RIF vírus údolnej horúčky). Používajú sa dve možnosti infekcie.

Prvá možnosť. Embryá sú umiestnené na statíve vo vertikálnej polohe. V plášti nad stredom vzduchovej komory sa vytvorí otvor a ihla sa vloží do hĺbky 3,5-4 cm pod uhlom 45° k zvislej osi v smere opačnom k ​​umiestneniu embrya (obr. 20).

Obrázok 20. Infekcia kuracieho embrya do žĺtkového vaku (podľa Nicolaou et al.)

Druhá možnosť. Niekedy sa podobná cesta infekcie uskutočňuje na embryu horizontálne namontovanom na statíve; v tomto prípade je embryo na dne a žĺtok je nad ním. Otvor v škrupine sa uzavrie kvapkou roztaveného parafínu.

Infekcia v amniotickej dutine.

Na tento účel sa používajú embryá staré 6 až 10 dní. Metóda sa používa na kultiváciu vírusov chrípky, pseudomoru hydiny, rhinopneumónie koní atď. Existujú dva spôsoby infekcie.

Uzavretá metóda. Infekcia sa vykonáva v zatemnenej krabici. Vajíčko sa umiestni na ovoskop vo vodorovnej polohe embryom nahor. Ihla s tupým koncom sa zavedie cez otvor v plášti nad vzduchovou komorou smerom k embryu. Dôkazom toho, že ihla prenikla do amniónu, je pohyb tela plodu v smere pohybu.

Otvorená metóda.Škrupina nad vzduchovou komorou sa odreže tak, aby sa vytvorilo okienko s priemerom 1,5-2,5 cm, cez ktoré sa pod kontrolou zraku pinzetou odstráni podškrupinová membrána. Potom sa vedú anatomické (14 cm) pinzety so zatvorenými čeľusťami, ktoré tlačia chorioallantoickú membránu smerom k embryu. Keď sa k nemu pinzeta dostane, čeľuste sa otvoria, uchopia plodovú membránu spolu s CAO a vytiahnu ju k oknu. Držaním pinzety s upevnenou amniovou membránou ľavou rukou sa zavádza materiál obsahujúci vírus (obr. 21). Potom sa všetky škrupiny spustia, okno sa uzavrie lepiacou náplasťou a embryo sa inkubuje vo vertikálnej polohe.

Obrázok 21. Infekcia kuracieho embrya v amnione otvorená metóda(podľa Nikolaou et al.)

Infekcia v krvných cievach XAO.

Pri ovoskopovaní embryí starých 11-13 dní sa zaznamená veľká krvná cieva. Ako postupuje, časť škrupiny sa odstráni, aplikujú sa 1-2 kvapky alkoholu, čím sa membrána škrupiny na chvíľu stane priehľadnou. Pod kontrolou oka pomocou ovoskopu sa ihla zavedie do cievy, čo sa potvrdí jej pohyblivosťou pri malých laterálnych pohyboch ihly. Odkrytá oblasť podškrupinovej membrány je pokrytá kúskom lepiacej omietky.

Materiál možno do nádob zaviesť aj trochu iným spôsobom: obal nad vzduchovou komorou sa odreže, podplášťová membrána sa navlhčí alkoholom a materiál sa zavedie do nádob XAO, ktoré sa stali viditeľnými. Otvor je prelepený kúskom sterilnej lepiacej pásky.

Opísané technické metódy na experimentálnu infekciu kuracích embryí nie sú jediné, ale majú rôzne možnosti.

Infekcia v tele embrya.

Na infekciu sa používajú embryá staré 7-12 dní. Sú známe dve verzie metódy.

Prvá možnosť. Infikujte rovnakým spôsobom ako v amnione uzavretým spôsobom, len s tým rozdielom, že berú ostrú ihlu a na ovoskope sa za indikátor vstupu ihly do tela považuje podriadenie embrya pohybom ihly.

Druhá možnosť. Amnion infikujú rovnakým spôsobom ako otvoreným spôsobom: cez okienko v škrupine sa telo embrya vytiahne pinzetou. Materiál sa vstrekuje do mozgu alebo špecifických oblastí tela. Pri takýchto infekčných metódach existuje významné percento nešpecifickej smrti embryí.

Akumulácia vírusu v kuracích embryách

Pred ďalšou inkubáciou na škrupinu kuracích embryí infikovaných akoukoľvek metódou jednoduchou (grafitovou) ceruzkou napíšu, čím a kedy je embryo infikované, prípadne aj ďalšie informácie. Infikované kuracie embryá sa umiestnia do termostatu na ďalšiu inkubáciu, počas ktorej sa zavedené vírusy reprodukujú a akumulujú v zodpovedajúcich štruktúrach. Inkubačná teplota embryí sa pohybuje od 33 do 38 °C v závislosti od vlastností vírusu, ktorým bola infekcia vykonaná. Embryá sú neustále monitorované, vyšetrované na ovoskope a vyberané mŕtve.

Smrť embryí v prvých 24 hodinách po infekcii je najčastejšie spôsobená premnožením húb, bakteriálnej mikroflóry zavedenej do embrya spolu s inokulom alebo poranením pri infekcii. Táto smrť sa považuje za nešpecifickú. Neskôr embryá spravidla odumierajú v dôsledku množenia vírusu v embryách. Po objavení mŕtvych embryí sa ihneď prenesú do chladničky pri teplote 4 °C. Takéto podmienky na jednej strane prispievajú k zachovaniu aktivity vírusu nahromadeného v embryu, na druhej strane k zhutneniu tkanív a vyprázdneniu ciev, čo značne uľahčuje následnú disekciu.

Embryá sa inkubujú, kým nedôjde k maximálnej akumulácii vírusu. Pre každý vírus a dokonca aj kmeň je toto obdobie špecifické a pohybuje sa od 2 do 7-8 dní. Pre kmeň vírusu pseudomoru hydiny je to 2-3 dni, pre rovnaký vírusový kmeň B - 5 dní, pre vírus vtáčej infekčnej laryngotracheitídy - 5 dní atď. Potom sa všetky embryá usmrtia ochladením na 4 °C aspoň 3-4 hodiny a otvorené.

Deembrinované vajcia.

Metóda je založená na odstránení embrya z vajíčka v období, keď chorioalantoická membrána zvnútra úplne prilieha k jeho škrupine. Ak sa do takéhoto vajíčka pridá živné médium, vytvorí sa akási tkanivová kultúra, v ktorej sa vírus môže množiť. Metóda má množstvo výhod: umožňuje získať čistejší vírus ako v alantoicko-plodovej tekutine, čo je dôležité pre zníženie alergénnych vlastností vakcín pripravených z tohto materiálu; Neprítomnosť žĺtkového vaku, a teda špecifických protilátok v ňom obsiahnutých, umožňuje lepšie množenie niektorých vírusov. V niektorých prípadoch táto metóda dáva dobré výsledky v diagnostickej práci, pretože s ním môžete zadať veľké množstvá testovaného materiálu, čo zvyšuje možnosť izolácie vírusu.

Metóda bola navrhnutá Bernkopfom už v roku 1949, ale kvôli ťažkostiam pri aplikácii nie je široko používaná. Tieto ťažkosti sú spojené s vlastnosťou chorioalantoickej membrány oddeliť sa od obalu počas inkubácie, čo znižuje hodnotu kultúry a komplikuje manipuláciu pri získavaní vírusu a nahrádzaní živného média.

E. Groiel (1963) zaviedol množstvo modifikácií, ktoré tieto ťažkosti odstránili. Navrhol použiť 15-dňové alebo ešte staršie vajcia, ktoré by sa mali počas inkubácie často otáčať, aby sa zabezpečilo rovnomerné rozvinutie škrupiny na škrupine. Pri presvetlení sú vyznačené hranice vzduchovej komory. Škrupina sa odpíli 0,5 cm nad touto čiarou, na okraj škrupiny sa naleje roztavený parafín (56-58 C°), ktorý stvrdne a zafixuje okraj vajíčka. Potom nakrájajte okrúhly otvor v škrupine nad embryom, pričom okolo zostáva úzky okraj. Ďalším krokom je opatrné vybratie embrya z vajíčka. V tomto prípade treba vajíčko držať vo vodorovnej polohe a pomaly otáčať. Týmto spôsobom sa nájdu cievy spájajúce embryo s CAO a prestrihnú sa nožnicami. Ak je vajce držané vertikálne, potom embryo svojou hmotou stiahne škrupinu, zvyčajne ju odtrhne v oblasti ostrého konca vajíčka. Vstup aj malého množstva tekutiny medzi chemické látky a škrupinu spôsobí úplné oddelenie škrupiny v priebehu 1-2 dní.

Po vybratí embrya sa membrána lemujúca vajíčko niekoľkokrát premyje soľným roztokom ochladeným na 4-0 °C, kým sa tekutina nestane čírou. Potom sa do dutiny vajíčka zavedie 20 ml živného média zahriateho na 37 ° C a vajce sa uzavrie sterilným gumeným uzáverom, ktorý sa predtým ponorí do parafínu. Rúrka s gumovou zátkou zapustená vo vajíčku umožňuje odber aj podanie tekutiny bez rizika bakteriálnej kontaminácie. Takýto biologický objekt zostáva životaschopný niekoľko dní.

Podľa metódy Yoshina a iných sa dutina deembrinovaných vajec naplní roztokom agaru v Hanksovom roztoku. Deembrinované vajíčka sa infikujú cez hadičku v uzávere.

Kontrolné otázky:

1. Štruktúra kuracieho embrya.

2. Prečo sa vo virológii používajú kuracie embryá?

3. Aká je štruktúra vyvíjajúceho sa kuracieho embrya?